Cô lập hợp chất thiên nhiên bằng phương pháp sắc kí cột

[ancistrocladus]

Theo mình thì nên cố gắng tách bằng các phương pháp có sẵn trong Lab của các bạn trước khi đem đi thuê chạy trên pHPLC. Thứ nhất là vì thiết bị này chưa thịnh hành ở VN và thứ hai là tốn kém. Một số điểm bạn cần cố gắng làm trước khi bó tay ngồi chờ cứu viện của các thiết bị mà bạn không có sẵn, theo tôi như sau:
-Cố gắng tách các vết ra khỏi nhau trên bản mỏng phân tích, anlytical TLC-0.25 mm , với sự khác nhau của ∆Rf ít nhất là 0.015. Khảo sát với thật nhiều hệ dung môi khác nhau vì có thể hệ này không tách nhưng sang hệ khác nó lại tách, vì để tạo ra một resolution đủ lớn thì các bạn biết rồi là nó phụ thuộc vào tính phân cực (polarity) và tính lựa chọn (selectivity factor) của hệ dung môi (còn yếu tố khác như pha tĩnh là silica gel thì đã bị cố định bởi nhà sản xuất mất rùi). Các giá trị Rf nên nằm từ 0.25 -0.55 vì trong khoảng này có sự ổn định khi chuyển sang tách trên cột silica gel (40-63 µm) với cùng 1 loại dung môi. Nếu chạy sắc ký cột nhanh FCC thì cần ∆Rf ít nhất là 0.1 thì tách mới dẽ không thì sẽ cần chạy trên cột có chiều cao và chạy chậm để tách các ∆Rf khoảng 0.03. Với các alkaloid thì người ta dùng thuốc thử Dragendoff và hay dùng hệ dung môi TCM/MeOH hoặc TCM/M/nước đôi khi cần thêm các bazo vào như là TCM bão hòa NH3 hoặc bazo hưu cơ. Để thay TCM người ta hay dùng DCM cho đỡ đôc. Như tách hiệu quả thì TCM vẫn hữu dụng hơn dù là trên TLC khoẳng cách Rf gần giống nhau, điều này là do hệ dm có TCM với hệ có DCM thể hiện tính lựa chọn khác nhau. Tính lựa chọn thể hiện rõ nhất khi tách các terpenoids đang dùng hệ dung môi H/EtOAc mà chuyển sang chạy DCM/ AC hoặc TCM/MeOH có độ phân cực tương đương (khoảng cách Rf như nhau), ở 1số ít trường hợp vết thấp chuyển vị trí cho vết cao và ngược lại, cứ như trên RP-TLC vậy.
Với các hỗn hợp phân cực như peptides, saponins, glycosides hoặc flavonoid glycoside thì khó tách hơn, người ta vẫn thích dùng TCM/MeOH/nước như 70/30/3; 30/9/1; 65/25/4; 65/35/10; BuOH/AcOH/H2O = 5/1/4; EtOAc/MeOH/H2O = 8/1/1 hoặc EtOAc/MeOH/H2O/toluene = 100/15/14/2 và rất nhiều hệ khác hiệu quả tách cao. Chúng ta chỉ cần khảo sát kỹ thì chọn được hệ dung môi thích hợp dễ tách, dễ cô cất dung môi, rẻ tiền và không độc hại.
Với các hỗn hợp nhỏ hơn 50 mg thì chay cột nhỏ từ các pipet nhỏ hoặc ai biết đổ pTLC thì càng nhanh, đưa chất lên bản mỏng và triển khai sau đó cạo ra và rửa giải trong 1 pipet nhỏ là đủ. Chỉ cần độ tinh khiết 94-95% là chạy NMR ngon lành rùi. Đôi khi hỗn hợp đồng phân 85-90 % cũng phải chịu thôi.
Cuối cùng nễu qua rất nhiều hệ dm mà vẫn không tách được trên TLC thì thôi đành test thử với RP-TLC vậy thôi. Tiếp theo là tách thử trên RP-SPE như Sep-Pak C18 trước khi dựng cột C18 lên. Nếu mà vẫn không tách được trên open ODS (Đôi khi SEPABEADS hạt nhỏ hoặc Diaion HP-20 chạy với dm MeOH/H2O hoặc Sephadex LH20 với hệ dm H/DCM/MeOH = 5/5/2; DCM/MeOH =5/5 hoặc MeOH lại có thể giải quyết được) thì đành mang ra cầu kiu pHPCL.